Le Bois du Roi représente un très bel exemple de la chênaie-charmaie famennienne (habitat Natura 2000). Le sous-bois est particulièrement riche en Sorbus torminalis. Dans les clairières, les layons de chasse et le long des lisières se maintiennent notamment quelques fragments de landes mésotrophes à Calluna vulgaris, des pelouses sèches sur schistes à Potentilla argentea et Silene nutans, et des prés du Molinion à Succisa pratensis.
Un groupement végétal rare et très localisé s'y observe sur les chemins schisteux humides. Il s'agit du Nanocyperion flavescentis, auquel se joignent plusieurs éléments du Cicendion filiformis. Cette végétation remarquable a été étudiée notamment par SAINTENOY-SIMON et al. (1995). Elle se compose de plusieurs plantes de petite taille, en forte régression en Wallonie: Lythrum hyssopifolia, Gypsophila muralis, Centunculus minimus, Lythrum portula, Isolepis setacea, Hypericum humifusum, accompagnées de Gnaphalium uliginosum, Juncus bufonius, Juncus tenageia, Cicendia filiformis (découverte en 2009), Kickxia elatine, Anagallis arvensis, ... S'y mèlent encore des éléments de bas-marais comme Agrostis canina, Ranunculus flammula, Carex demissa, et diverses autres plantes telles que Agrostis stolonifera, Prunella vulgaris, Juncus articulatus, Lysimachia nummularia, Mentha arvensis, Lotus pedunculatus, Lycopus europaeus, Scutellaria galericulata, Alchemilla cf. vestita, Centaurium erythraea, Polygonum aviculare, Poa annua, Persicaria hydropiper, ...
Ces ornières à Cicendia filiformis et Centunculus minimus, habitat Natura 2000 très rare en Wallonie, ont fait l'objet d'une étude détaillée par COUVREUR et al. (2011).
La faune est remarquable et est suivie depuis 1989 par M. PAQUAY, agent technique de la Donation royale.
L'avifaune nicheuse comporte l'autour des palombes (Accipiter gentilis), l'épervier d'Europe (Accipiter nisus), le pic noir (Dryocopus martius), le pic mar (Dendrocopos medius), le pic épeichette (Dendrocopos minor), la bondrée apivore (Pernis apivorus) et bien d'autres espèces.
Parmi l'herptétofaune il faut souligner l'existence d'une population prospère de Lézard vivipare (Zootoca vivipara).
Le Bois du Roi héberge une entomofaune d'une diversité assez exceptionnelle. La plupart des papillons forestiers sont présents, dont le Grand mars changeant (Apatura iris), le Moyen nacré (Argynnis adippe), le Tabac d'Espagne (Argynnis paphia), le Grand collier argenté (Boloria euphrosyne), le Petit sylvain (Limenitis camilla), le Damier athalie (Melitaea athalia), le Thécla de l'yeuse (Satyrium ilicis), etc. On y observe aussi le long des lisières et dans les clairières l'Argus vert (Callophrys rubi), l'Echiquier (Carterocephalus palaemon), le Petit collier argenté (Boloria selene), le Céphale (Coenonympha arcania), la Lucine (Hamearis lucina), la Piéride de la moutarde (Leptidea sinapis), le Demi-deuil (Melanargia galathea), le Damier noir (Melitaea diamina), l'Hespérie de la mauve (Pyrgus malvae), etc.
Parmi les Lépidoptères hétérocères (ou papillons de nuit), diverses espèces rares y sont signalées, dont le géomètre Eustroma reticulatum, dont la chenille est liée à Impatiens noli-tangere (voir PIRLET, 2000), ainsi que la superbe noctuelle Catocala fraxini.
Deux espèces de coccinelles sont particulièrement à épingler: la Coccinelle éclatante (Coccinella magnifica), qui se tient exclusivement autour des nids des Formica du groupe rufa, et la Coccinelle à hiéroglyphes (Coccinella hieroglyphica), liée aux landes à callune mais non revue récemment.
Le site accueille un large cortège de Coléoptères Cerambycidae, dont le très rare Anoplodera rufipes. Une population importante de la cétoine myrmécophile Protaetia metallica est également notée au niveau des fourmilières de fourmis des bois.
Les Hémiptères sont très bien représentés mais leur inventaire exhaustif reste à réaliser. On y observe notamment les punaises Aneurus avenius, Metatropis rufescens, Ortholomus punctipennis, Pitedia pinicola, et les cicadelles Ledra aurita et Arthaldeus arenarius (cette dernière espèce étant nouvelle pour la faune belge!).